Страница не найдена

 

МЕНЮ


Главная страница

РАЗДЕЛЫ


Атипичная пневмония
Вирус mers
Вирус Зика
Вирус Эбола
Корь
Лихорадка Денге
Лихорадка Ласса
СПИД
Сибирская язва
Туберкулез
Холера
Вирус гриппа
гонконгский грипп
Птичий грипп
Эпидемия гриппа 2017

АРХИВ


Март 2018 (111)
Февраль 2018 (176)
Январь 2018 (237)
Декабрь 2017 (187)
Ноябрь 2017 (188)
Октябрь 2017 (194)
Сентябрь 2017 (176)
Август 2017 (111)
Июль 2017 (111)
Июнь 2017 (204)
Май 2017 (174)
Апрель 2017 (179)
Март 2017 (155)
Февраль 2017 (202)
Январь 2017 (249)
Декабрь 2016 (329)
Ноябрь 2016 (256)
Октябрь 2016 (194)
Сентябрь 2016 (182)
Август 2016 (207)
Июль 2016 (137)
Июнь 2016 (120)
Май 2016 (106)
Апрель 2016 (87)
Март 2016 (150)
Февраль 2016 (481)
Январь 2016 (433)
Декабрь 2015 (198)
Ноябрь 2015 (141)
Октябрь 2015 (109)
Сентябрь 2015 (121)
Август 2015 (59)
Июль 2015 (58)
Июнь 2015 (97)
Май 2015 (19)
Апрель 2015 (23)
Март 2015 (57)
Февраль 2015 (47)
Январь 2015 (78)
Декабрь 2014 (89)
Ноябрь 2014 (101)
Октябрь 2014 (48)
0000 (1)

2018-03-16 10:10




Новое оружие в борьбе с раком: химерный антигенный рецептор

Ассасину для успешного выполнения задания необходимо знать, как выглядит его цель. Его противник – вооружённая группа диверсантов, подавляющая боевой дух и оборонительные способности союзников. После нескольких минут разведки ассасин отправляется в атаку, молниеносно определяет, а затем бесшумно устраняет противника, практически не выдавая себя и не оставляя следов. Этот сценарий вполне может подойти для описания активности иммунных клеток против раковых клеток.

Наши ассасины – это экспериментальная разработка «молекулярной хирургии», которые получили название CAR-T cells (Chimeric Antigen Receptor-T). Они проходят обучение в специализированных лабораториях под контролем опытных врачей и ученых, снабжаются новейшим оружием. Их цель – распознать определенные молекулы на поверхности опухоли и ликвидировать малигнизированные клетки.

Сегодня речь пойдет об одном из наиболее перспективных направлений в терапии злокачественных новообразований – иммунотерапии, а конкретно – об адоптивной иммунотерапии на основе химерных Т-клеточных рецепторов (CAR), направленных к специфическим опухолевым антигенам. Адоптивная терапия основана на извлечении клеток иммунной системы из организма, затем их модификации с целью приобретения противоопухолевых свойств, последующего наращивания и реинфузии пациенту.

В начале необходимо упомянуть важную роль иммунной системы в противодействии или ликвидации формирования и прогрессии ранней неоплазии, опухолей на поздних стадиях и микрометастазов. Феномен спонтанной регрессии опухоли подтверждает этот тезис. Также о роли иммунной системы свидетельствует возрастание вероятности развития злокачественных опухолей при состояниях, сопровождающихся выраженной иммуносупрессией, в частности при пересадке органов.

Согласно устоявшейся теории иммунного контроля, клетки и ткани организма подвергаются мониторингу со стороны иммунной системы. Такой контроль ответственен за распознавание и элиминацию подавляющего большинства ранних опухолевых клеток и, как следствие, зарождающихся опухолей, однако опухоли в процессе развития приобретают многие черты, позволяющие им ускользать от иммунного надзора – этот процесс называется «Immunoediting» (иммуноредактирование). (изображение №2)

Опухоль развивается из собственных клеток организма, и в связи с этим она не является иммунологически чужеродной (исключение – вирус-индуцированные опухоли). Опухолевые клетки не распознаются адаптивным иммунитетом (потому что происходит потеря опухолевого антигена или нарушается процесс презентации антигена) и становятся нечувствительным к иммунным эффекторным механизмам. К тому же опухолевое микроокружение – чрезвычайно хитрое изобретение рака, в котором происходит секреция иммуносупрессивных факторов, таких как IL-10, TGF, IL-6, Galectin-1, IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), VEGF, которые делают невозможным эффективное распознавание и уничтожение аномальных клеток иммунной системой. Также опухолевые клетки могут продуцировать молекулы PD-L1 и PD-L2 (иммунные контрольные точки), которые ингибируют деятельность Т клеток.

В результате опухолевой прогрессии происходит накопление мутаций в клетках опухоли, и появляются новые мутантные макромолекулы, являющиеся мишенями для компонентов иммунной системы. Поэтому ученые стараются дать новые возможности иммунным клеткам (в нашем случае это цитотоксические Т-лимфоциты) «пощупать» молекулярную структуру опухоли, оснастить их собственной «системой наведения», придать им устойчивость к иммуносупрессии для увеличения выживаемости, а после этого помочь проникнуть в строй раковых клеток.

СТРОЕНИЕ ХИМЕРНОГО АНТИГЕННОГО РЕЦЕПТОРА:

CAR T-клетки являются аутологичными цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые с помощью генной инженерии запрограммированы для экспрессии связывающего участка специфических антител: у Т-клеток появляется способность связывания специфического опухоль-ассоциированного антигена (TAA). В основном химерные антигенные рецепторы отражают в своей структуре нормальные Т-клеточные рецепторы, но имеют характерные отличия. (изображение №3)

CAR – рекомбинантный рецептор, состоящий из трех основных частей:

1) Внеклеточный домен (распознающая часть) – одноцепочечный вариабельный фрагмент необходимой специфичности, полученный от моноклонального антитела, у которого фрагменты легкой и тяжелой цепи связаны полипептидным линкером (single-chain variable fragment, scFv) – Targeting Domain. Его задача – распознавание опухоль-специфического антигена и образование антиген-связывающего участка. Цель такой модификации заключается в том, чтобы придать Т-клеточному рецептору способность распознавать поверхностные опухолевые антигены независимо от MHC, сохранять внутриклеточные сигнальные пути и функционал Т-лимфоцитов. К тому же они приобретают способность распознавать антигены небелковой природы, такие как углеводы, ганглиозиды, протеогликаны и др.

2) Шарнирный трансмембранный домен и спейсер (связывающий участок) – соединяют между собой внеклеточный и внутриклеточные домены и выполняют важную функцию – придают рецептору большую гибкость и повышают доступность для связывания, выводя антиген-распознающую часть рецептора за пределы гликокаликса Т-лимфоцитов. Как правило состоят из гомо- или гетеромебранных белков, таких как CD4, CD8, CD28, CD247. Различные спейсерные регионы могут приводить к заметным различиям в секреции цитокинов и цитотоксических свойствах Т-клеток. Кроме того, они могут влиять на взаимодействие между CAR-инженерными Т-лимфоцитами и другими элементами иммунной системы.

3) Внутриклеточный сигнальный и ко-стимулирующий домен (часть передающая сигнал) – состоит из нативного рецепторного комплекса Т-лимфоцитов (CD3-zeta) и одного или более ко-стимулирующих доменов, заимствованных у ко-стимуляторных рецепторов, как правило – CD28 или 4-1BB (CD137). Благодаря этому домену происходит активация Т-клеток, усиливается их пролиферация и выработка цитокинов, происходит возрастание их цитотоксической активности, повышается продукция антиапоптотических факторов для предотвращения гибели Т-клеток.

(изображение №4)

За все время существования химерных антигенных рецепторов, а это около 20 лет, ученые постоянно стараются их модифицировать. На сегодняшний день, существует уже 4 поколения CAR, и разрабатываются новые модели и концепции для их усовершенствования, такие как: “Armoured” CARs – секретируют провоспалительные цитокины, например, IL-12; двойные CAR, экспрессирующие опухоль специфический антиген и химерный цитокиновый рецептор 4-??; комбинированная терапия с блокаторами иммунных чекпоинтов; использование технологии CRISPR для создания CAR и многое другое. (изображение №5)

Все конструкции CAR, используемые в настоящее время в клинических испытаниях (1 и 2 фазы - https://vk.cc/6DKBQ7), представляют собой CAR второго поколения, состоящие из CD28 или 4-1BB (CD137), но сразу же хочется отметить, что CAR Т-клетки – это не чудодейственное лекарство от рака. Несмотря на ремиссию некоторых видов опухолей, у группы пациентов отмечаются побочные эффекты, зафиксированы случаи летального исхода в ходе клинических испытаний.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ CAR T-КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ:

1) CAR T-клетка распознает и связывается с таргетным антигеном на опухолевых клетках.

2) Связывание индуцирует конформационное изменение, которое передает сигнал через клеточную мембрану Т-лимфоцита внутрь клетки.

3) Внутри клетки рецепторы второго поколения доставляют как первичный сигнал активации через CD3-zeta, так и ко-стимулирующий сигнал через CD28 или 4-1BB домены.

4) Активированные цитотоксические CAR Т-клетки образуют иммунологический синапс, который в последствии перестройки принимает вид микрополости, через которую секретируются клетки секреторных лизосом, содержащих молекулы перфорина и гранзимов. Перфорин является аналогом компонента комплемента С9. Затем происходит полимеризация молекул перфорина и через данную структура проникают молекулы гранзимов и гранулизинов. Основная роль гранзимов при проникновении в клетку заключается в активации каспаз, в частности каспазы 3, запускающей апоптоз (альтернативный путь – митохондриальный апоптоз). Другой путь индукции апоптоза клетки-мишени является FAS-лиганд (белок суперсемейства белков факторов некроза опухоли) зависимый механизм, который также инициирует каспазный каскад, приводящий к протеолизу многих жизненно важных белков клетки и запуску апоптоза. Также происходит выделение интерлейкина-2 (IL-2), которое может способствовать выживанию Т-клеток. Интерферон (IFN)-гамма может активировать врожденный иммунный ответ. (изображение №6)

ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА CAR Т-КЛЕТОК:

1) Как правило, лейкоциты от пациента собираются с помощью лейкофереза

Ключевым параметром, необходимым для производства терапевтического клеточного продукта, служит сбор достаточного количества Т-лимфоцитов, ориентировочно около 100 ? 10^6 клеток, поэтому сбор желательно проводить до проведения курсов химиотерапии.

2) Необходимый фенотип Т-клеток отбирается с помощью процедуры проточного центрифугирования с элютриацией.

3) Полученные лимфоциты перемещаются в культуру и активируются с помощью синтетического поликлонального активатора, связывающегося с рецепторами CD3 и CD28;

4) Производится доставка вирусного вектора. Наиболее часто для этой цели используют ретровирусные векторы, в том числе полученные из гамма-ретровирусов и лентивирусов. Это небольшие, РНК-содержащие вирусы. Путем обратной транскрипции происходит встраивание вектора и переносимого генетического материала непосредственно в геном клетки-мишени, что обеспечивает их постоянную экспрессию.

5) Экспансия клеточной культуры в биореакторе в течение нескольких дней под действием цитокинов, поддерживающих пролиферацию Т-лимфоцитов, - IL-2, IL-7, IL-15.

6) Полученный Т-клеточный продукт промывается и концентрируется.

7) Пробы отправляются на контроль качества клеточного продукта – тестирование на микробиологическую безопасность, эффективность трансдукции и функциональную активность Т-лимфоцитов.

8) Клеточный продукт криоконсервируется для удобства транспортировки.

9) Готовый Т-клеточный продукт размораживают и производят инфузию пациенту. (изображение №7)

КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ ТЕРАПИИ CAR T-КЛЕТКАМИ:

По данным National Institutes of Health сейчас в мире проводится около 150 клинических испытаний новых CAR к поверхностным антигенам опухолей. Основная часть исследований посвящена лимфопролиферативным заболеваниям, однако примерно 30% работ сфокусировано на солидных опухолях (нейробластома, рак молочной железы, рак легкого и др.). Еще больше исследований находятся на доклинической стадии, и публикуемые результаты позволяют рассчитывать на значительный прогресс в этом, ещё новом, направлении противоопухолевой терапии. Почти идеальным антигеном-мишенью является CD19, представляющий собой линейно-специфичный тканевой антиген, экспрессированный практически на всех этапах дифференцировки В-лимфоцитов, за исключением плазматических и стволовых гемопоэтических клеток. CD19 экспрессируется на поверхности опухолевых клеток почти всех В-линейных опухолей (острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфолейкоз, В-клеточные неходжкинские лимфомы). К тому же, антитела против СD19 ингибируют рост опухолевых клеток. Именно с использованием СD19-CAR Т-клеток (=CTL019) были получены первые успешные результаты терапии.

В январе 2016, Пенсильванский Университет и Детская больница города Филадельфия, при поддержке «Novartis Pharmaceuticals», провели клинические испытания препарата CTL019 (СD19-CAR Т-клетки трандуцированные лентивирусом и содержащиие 4-1BB костимуляторные домены), в ходе испытаний более чем 200 пациентов, подверженных ОЛЛ, ХЛЛ, неходжкинсокой лимфоме, прошли курс терапии. Согласно последним данным в области исследований CTL019, представленным Europian Hematology Association, 45 из 48 пациентов педиатрического отделения (94%) достигли терапевтического ответа, выживаемость без прогрессирования 76% при медиане наблюдения 6 месяцев. У 13 пациентов в течении года произошла ремиссия и было отмечено несколько случаев синдрома «цитокинового шторма».

В другом исследовании 14 пациентов с резистентным / рецидивирующим течением хронического лимфолейкоза получили терапию CD19 CAR T-клетками с 4-1BBz костимулирующим доменом в дозе от 0,14 ? 108 до 11 ? 108 CTL019 клеток. Полный ответ был получен в 29% случаев, частота суммарного объективного ответа (objective response rate, ORR) составила 57%. В этой группе пациентов была обнаружена длительная персистенция терапевтических клеток (до 4 лет). К слову, длительная персистенция Т-лимфоцитов оказывает неблагоприятное воздействие на организм пациента, в частности из-за синдрома «цитокинового шторма», поэтому ученые из Калифорнийского университета в Сан-Франциско создали молекулярный «выключатель», с помощью которого можно управлять действиями генноинженерных Т-лимфоцитов. Одним из способов такого «выключения» служит трансдукция Т-лимфоцитов так называемыми суицидальными генами (suicidal genes), продукты которых, под действием специфических малых молекул, запускают апоптоз Т-лимфоцитов.

Одним из важных наблюдений стала потеря экспрессии CD19 опухолевыми клетками при развитии рецидива острого лимфобастного лейкоза после терапии. Заключения всех исследовательских групп подтвердили: этот механизм является ведущим в развитии рецидива при терапии CAR Т-клетками. В этой связи, одним из возможных решений является одновременное таргетирование нескольких антигенов на поверхности опухоли, что теоретически должно снизить риск «ускользания» опухоли от эффекторных механизмов иммунной системы. В настоящее время ученые занимаются поиском новых антиген-мишеней, которые продуцируют опухоли, вот некоторые из них:

А) Таргеты для CAR Т-клеточной терапии гематологических новообразований проходят клинические испытания, которые включают CD20, CD22, ROR1, Ig?, BCMA, CD138, CD33, CD123 и LewisY antigen.

Б) Таргеты для CAR Т-клеточной терапии солидных форм опухолей включают PSMA, FAP, CEA, CD171, GD2, glypican?3, HER2 и IL?13R?.

Несмотря на интересные результаты в клинических исследованиях, терапия CAR T-клетками пока что еще не одобрена. В общей сумме было проведено огромное количество клинических испытаний для терапии различных типов опухоли, но существующие платформы, безусловно, нуждаются в совершенствовании с точки зрения как безопасности, так и эффективности терапии. (изображение №8)

НЕДОСТАТКИ И ПОБОЧНЫЕ ЭФФЕКТЫ ТЕРАПИИ CAR T-КЛЕТКАМИ:

1) В-лимфопения, обусловленная закономерной деплецией пула нормальных В-лимфоцитов – не угрожающее для жизни пациента состояние, которое может быть скорректировано клиническими инструментами.

2) Синдром «цитокинового шторма» (CRS – cytokine release syndrome) – на сегодняшний день наиболее тяжелое осложнение терапии CAR T-клетками. Отличительной чертой CRS является повышение иммунного ответа, который приводит к значительному увеличению воспалительных цитокинов. Клинические и лабораторные показатели CRS варьируются от умеренной до тяжелой CRS (потенциально жизнеугрожающие состояния). Клинические проявления включают в себя: повышение температуры, усталость, миалгию, тошноту, анорексию, тахикардию, гипотонию, капиллярные кровотечения, сердечная дисфункцию, почечную и печеночную недостаточность, эритематозную, зудящую сыпь. В основном увеличивается концентрация таких цитокинов, как: INF-gamma, гранулоцитарный колоние-стимулирующий фактор, IL-10, IL-6.

3) Нейротоксичность, проявляющаяся спутанностью сознания, делирием, афазией, миоклонусом, судорогами, галлюцинациями. Механизмы данного осложнения не установлены.

4) Возможность возникновения реакции «трансплантат против хозяина», так как химерные Т-лимфоциты не являются строго специфичными для опухолевой ткани. (изображение №9)

Источники:

1. Павлова А.А, Масчан М.А., Пономарев В.Б. Адоптивная иммунотерапия генетически модифицированными Т-лимфоцитами, экспрессирующими химерные антигенные рецепторы. DOI: 10.17650/1818-8346-2017-12-1-17-32

2. «Т-клетки — марионетки, или как перепрограммировать Т-лимфоциты, чтобы вылечить рак» (https://biomolecula.ru/articles/t-kletki-marionetki-i..)

3. Making CAR T-Cell Therapy Safer