Группе французских ученых удалось снять процесс заражения здоровой клетки вирусом иммунодефицита человека(ВИЧ). Подавляющее большинство случаев заражения ВИЧ происходит через слизистые оболочки половых органов и прямой кишки, но внешний слой, или эпителий, этих тканей может иметь разные характеристики, и именно от них зависит, каким образом вирус проникает в организм. Процесс передачи ВИЧ еще недостаточно изучен, и мы слабо представляли себе точную последовательность событий, приводящую к инфицированию различных жидкостей, выделяемых во время полового акта.
Для отслеживания поведение вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1 в цитоплазме инфицированных клеток, ученые маркировали вирионы путем включения ВИЧ Vpr, слитого с GFP.
Vpr - белок ВИЧ, необходим для репликации вируса в неделящихся клетках, в том числе макрофагах. Этот белок, наряду с другими клеточными и вирусными белками, активирует транскрипцию с использованием длинных концевых повторов генома ВИЧ в качестве промоторов.
GFP - белок, выделенный из медузы "Aequorea victoria", который флуоресцирует в зелёном диапазоне при освещении его светом от синего до ультрафиолетового диапазона. В настоящее время ген белка широко используется в качестве светящейся метки в клеточной и молекулярной биологии для изучения экспрессии клеточных белков.
Одной из проблем было построение экспериментальной модели, имитирующей заражение слизистой половых органов жидким секретом, таким образом, чтобы весь процесс можно было снять на видео. Ученые воспроизвели in vitro слизистую мочеиспускательного канала мужчины на базе человеческих клеток, поверхность которой сделали красной, а зараженные белые клетки крови (Т-лимфоциты, основной инфекционный элемент в половых жидкостях) - флуоресцентными зелеными, и они, в свою очередь, производили такие же флуоресцентные зеленые частицы, зараженные ВИЧ. Флуоресценция была необходима, чтобы можно было визуально наблюдать за процессом и отслеживать проникновение ВИЧ в слизистую методом флуоресцентного сканирования в реальном времени. И наконец, система должна была обеспечивать возможность наблюдения за контактом между клетками под микроскопом.
Звездным моментом стал заснятый процесс разрыва цепочки вируса. Это было похоже на пистолет, выбрасывающий пули одну за другой. Весь процесс длился несколько часов, а затем зараженная клетка будто потеряла интерес к нему, отцепилась от остальных и начала перемещаться.
Что происходит на экране?
ВИЧ-инфицированные клетки имеют зеленый цвет и производят флуоресцентные вирусные частицы, которые здесь видны как зеленые точки. Видно, как ВИЧ-инфицированная клетка присоединяется к внешнему слою, эпителию, состоящему из здоровых клеток реконструированной слизистой половых путей. Клетки иммунной системы, макрофаги, которые обычно поглощают инородные тела, омертвевшую ткань и раковые клетки, сейчас поглощают красные частицы, которые медленно движутся возле синего ядра макрофага.
ВИЧ-инфицированная клетка подходит к поверхности слизистой и мягко присоединяется к ней. Установив контакт, зараженная клетка подтягивает уже готовые вирусные частицы к месту контакта (яркое желто-зеленое пятно) и начинает буквально выстреливать этими вирусами, обладающими инфективностью. Здесь они отображаются как зеленые точки. Эти вирусы проникают сквозь внешний слой ткани. Такой процесс называется трансцитозом, это один из видов трансцеллюлярного транспорта. Вирусы попадают в клетку и выходят с другой стороны эпителиального барьера, по-прежнему сохраняя свою инфективность. Таким образом ВИЧ поражает макрофаги, отвечающие за обнаружение, поглощение и уничтожение инородных тел. Дойдя до ядра, вирус встраивается в генетический материал, ДНК, и кровяные клетки, которые должны защищать организм, начинают вместо этого производить вирусы.
Что интересно, сделанная запись помогла понять, что процесс производства вирусов продолжается не так долго. Спустя три недели зараженные клетки иммунной системы погрузились в спящее состояние, и образовался некий резервуар с такими клетками.
Почему с ВИЧ так сложно бороться?
Вылечить ВИЧ-инфицированного человека сложно именно из-за спящих клеток иммунной системы. Часть из них постоянно просыпаются и начинают производить вирус, таким образом являясь долговременным источником вируса
То, что спящие клетки инфицированы, никак внешне не проявляется, так как они не производят вирусных белков, а только содержат генетический материал вируса. Поэтому их не могут обнаружить и уничтожить клетки-киллеры, так как они обнаруживают инфекцию по наличию вирусных белков. Когда человек принимает антиретровирусные препараты которые прерывают репликацию вируса, а иммунная система выявляет и уничтожает клетки, которые проснулись и производят вирусные белки транскрибируя вирусную ДНК. "Спящие" клетки представляют проблему если пациент перестает принимать антиретровирусные препараты, из-за наличия в них "резервуара" - встроенного в их хромосомную ДНК генетического материала вируса. В этом случае спящие клетки, которые проснулись, снова производят вирус, который без препятствия в виде антивирусной терапии, вновь может свободно распространяться в организме.
Источник: www.cell.com